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胚胎干细胞技术将被CRISPR取代

2018-11-28 15:33:35

胚胎干细胞技术将被CRISPR取代?

生物通报道:近年来,CRISPR/Cas9技术飞速发展,使用CRSPR系统将重组Cas9蛋白和合成引导性RNA注入小鼠受精卵,就能很容易的进行基因敲除和敲入。近在国际着名学术期刊《Genome Biology》发表的一项研究中,来自英国威康基金会桑格研究所的William C Skarnes博士撰写题为“Is mouse embryonic stem cell technology obsolete?”的研究亮点文章指出,这些新技术将很快取代使用胚胎干细胞的基因修饰,小鼠胚胎干细胞技术的终结是不可避免的。延伸阅读:NatMeth:新方法终结CRISPR-CAS9争论。

自从25年前小鼠胚胎干细胞(ESC)的发现以来,研究人员利用它们的特性,已经在核苷酸的精确度上,设计了越来越多复杂的遗传学改变。小鼠ESC因其很快的生长速度、易于转染和克隆,可高度服从于遗传修饰。外源供体载体和内源基因组之间较高的同源重组率,通常可在小鼠ESC中得以实现。多年来,基因打靶载体设计的持续改进,使得研究人员能够设计几乎携带任何所需基因修饰的小鼠。但是,小鼠ESC的卓越性现在正受到CRISPR及相关核酸内切酶Cas的挑战,后者能直接对小鼠胚胎进行遗传工程改造。

小鼠胚胎干细胞技术的一个明显缺点是,从ES细胞产生基因修饰小鼠的时间较长,过程也比较复杂。并不是所有的ES细胞系都是健壮的,ES细胞的基因组不稳定性是生殖系传递失败的原因之一。尽管存在诸多困难,到目前为止科学家已经从ES细胞产生了25,000种转基因小鼠品系。

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在小鼠ES细胞中进行基因打靶不久之后,研究人员开始质疑,同源重组是否可能存在于1-细胞胚胎中。很显然,同源重组在受精卵中的频率过低,不能提供ES细胞技术的可行替代方案。大约在同一时间,有研究小组在小鼠ES细胞中进行的实验表明,通过诱导靶位点的双链断裂,使用同源供体质粒的基因打靶效率增加了至少50倍。双链断裂不能通过同源重组修复,同源重组修复通常与易出错的非同源末端连接(NHEJ)的小插入或缺失特点相关。这些开创性的实验,为小鼠胚胎基因组奠定了基础,接着,出现了可编程的位点特异性核酸酶,初使用锌指核酸酶以及近的CRISPR-Cas9核酸酶。

目前,研究人员已经使用CRISPR-Cas9在小鼠受精卵及其他模式物种中,产生基本的等位基因。现在,NHEJ诱导的简单插入/缺失,或通过同源指导修复的单链寡核苷酸引入,通常可通过转基因设备进行。然而,更复杂的等位基因需要与一个供体质粒同源重组,通过受精卵注射更难产生。因为首建动物(Founder animal)通常是嵌合的,靶基因到下一代的传递是没有保证的。因此,要在小鼠ES细胞中进行各种各样可能的遗传修饰,就需要进一步完善Cas9辅助的小鼠受精卵基因打靶。

基于Cas9核糖核蛋白(RNP),有研究小组已经开发出了高效的方法,在小鼠中产生敲入基因。利用Cas9核糖核蛋白有几个优势。首先,看到的同源重组效率增加,部分是由于Cas9蛋白复合物是直接激活的。当用供体质粒传递给细胞核时,Cas9核糖核蛋白可立即促进靶位点的同源重组。其次,胚胎短时间地暴露Cas高活性,降低了嵌合体和脱靶损伤的可能性。

从实用的角度来看,合成引导性RNA使用非常方便,省去了克隆和体外纯化转录单引导性RNA的需要。使用重组Cas9蛋白和合成引导性RNA,研究人员在首建动物中看到了非常高频率的同源重组,这是非常令人鼓舞的。要确定这种方法是否推广到其他位点和其他脊椎动物,还需要更多的研究。

核酸酶辅助的基因组的引人瞩目,标志着遗传工程领域的一次革命。特别是,CRISPR-Cas系统使用简单,对胚胎和细胞进行修饰的试剂可以从供应商那里购买到。我们期望这些试剂质量和传递方法可以得到不断的改善。关于Cas内切酶的特异性,科学家对这项技术一直都有担忧,但是随着更多人报道在首建动物中很少或没有脱靶损伤,这些担忧将烟消云散。与在培养的胚胎干细胞中所看到的基因组不稳定性相比,CRISPR-Cas技术相对安全。有研究表明,Cas9辅助的基因打靶在小鼠胚胎中是非常有效的,从而使得研究人员能够对复杂的等位基因进行遗传改造。因此,现在看来,小鼠胚胎干细胞技术的终结是不可避免的。

(生物通:王英)

生物通推荐原文:William C Skarnes. Is mouse embryonic stem cell technology obsolete? Genome Biology 2015, 16:109 doi:10.1186/s(版权所有,未经书面许可,不得转载

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